深究DP2干预对大鼠海马神经元的作用论文
铝为地壳中含量最丰富的金属元素，人类日常生活中应用广泛，主要通过食物、化妆品及建筑材料等途径摄入。经证实，长期摄入大剂量铝会产生严重中枢神经系统毒性，表现为行为和认知功能障碍、神经元损伤，甚至神经退行性变，但其具体机制尚不完全清楚。前列腺素(PGs)是一类多不饱和脂肪酸衍生物，由环氧化酶(COX)催化花生四烯酸(AA)代谢产生，介导一系列生理病理过程。前列腺素D2(PGD2)是大脑中最丰富的PGs，其合酶(PGDS)有脑型PGDS(L睵GDS)和生血型PGDS(H睵GDS)两种亚型。在中枢神经系统，除少突胶质细胞外，L睵GDS高表达于神经元。PGD2与特异性受体DP1和DP2结合后，通过受体介导的信号传递机制而发挥广泛作用。DP1和DP2都是G蛋白偶联受体，分别偶联Gs和Gi蛋白，影响环磷酸腺苷(cAMP)水平而发挥不同作用。有研究报道，在PGD2 致原代大鼠皮层神经元损伤模型中，DP2 拮抗剂BAY瞮3405未发挥保护作用，推测DP2 可能不介导PGD2 的神经毒性。另也有研究报道，在谷氨酸致原代大鼠海马脑片损伤模型中，DP2激动剂DK睵GD2明显升高神经元的LDH漏出率及细胞死亡率，提示DP2介导PGD2的神经毒性。出现此矛盾结果，可能与研究模型不同有关。DP2作为DP受体中的一员，在铝盐致原代培养大鼠海马神经元损伤过程中具体是如何变化的，尚未见报道。目前广泛研究的DP2选择性激动剂主要有DK睵GD2、15d睵GD2、15d睵GJ2，DP2 选择性拮抗剂主要有CAY10471、AM461、AZD1981。参考Yue等的报道，我们选择DK睵GD2、CAY10471作为干预药物进行实验。我们前期实验结果表明，铝负荷原代培养大鼠海马神经元损伤模型中，L睵GDS表达明显上调，DP2表达明显下调，PGD2 含量明显升高，初步提示L睵GDS睵GD2睤P2信号通路可能参与了神经元损伤过程。在本实验中，我们采用DP2选择性激动剂和拮抗剂分别干预铝负荷神经元，进一步观察DP2在原代培养大鼠海马神经元中的作用。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 实验动物 选取孕期18d左右的SD大鼠，由重庆医科大学实验动物中心提供，合格证书号：SCXK(渝)2012-0002。
1.1.2 主要试剂与仪器 麦芽酚(阿拉丁，上海)，DMEM/F12、D睭ank′s(Hyclone，美国)，B27、Neuro瞓asal培养基、胎牛血清(Gibco，美国)，左旋多聚赖氨酸、MTT试剂盒(Sigma，美国)，青霉素-链霉素溶液、LDH试剂盒、Fluo3AM(碧云天，上海)，山羊抗兔特异性烯醇化酶(NSE)多克隆抗体(博士德，武汉)，SP试剂盒、DAB显色剂(中杉金桥，北京)，苏木精染液、伊红染液(南京建成，南京)，DK睵GD2、CAY10471(Cayman，美国)，超净工作台(苏州净化设备有限公司)，二氧化碳培养箱(ThermoSci瞖ntific，美国)，超纯水系统(Millipore，美国)，低温冷冻离心机(ThermoScientific，美国)，激光扫描共聚焦显微镜(Bio睷ad，美国)，全自动酶标仪(BioTek，美国)。
1.2 方法
1.2.1 大鼠海马神经元原代培养 取孕期18d左右的SD大鼠，断颈后迅速剪开腹部皮肤和腹膜，将子宫完全暴露后剪断肌层和脐带，取出胎鼠并立即浸泡于装有75%乙醇的烧杯中。约30s后，将消毒好的.胎鼠移入事先准备的D睭anks液中，断头取脑，迅速分离出两侧完整海马，放入冰浴的D睭anks液中，用眼科剪将海马组织剪碎。加入组织体积5倍左右的0125%胰酶，混匀，37℃培养箱内消化，10min时拿出轻轻吹打数次。20min后，加入同体积的含10%胎牛血清培养液终止消化。200目细胞网筛过滤，收集细胞悬液，800r·min-1离心10min。弃去上清，加入一定量的含10%胎牛血清培养液重悬细胞，制成细胞密度为1×106·L-1的细胞悬液。吸取不同体积细胞悬液分别接种于左旋多聚赖氨酸包被好的培养板、培养皿及培养瓶中，置于37℃、5% CO2的培养箱中培养。4h后，待神经元贴壁，换含2% B27的Neurobasal培养液继续培养，以后每隔3d半量换液1次。海马神经元培养至d7时长到较好状态，可进行后续实验。
1.2.2 原代培养大鼠海马神经元的免疫化学鉴定 取6孔培养板中培养至d7的海马神经元爬片(10mm×10mm)，弃去细胞培养液用PBS漂洗3次;4%多聚甲醛固定30min，PBS漂洗3次，每次2min;3% H2O2 孵育15min，PBS漂洗3次，每次2min;10%山羊血清封闭，37℃孵育20min，吸干血清，不漂洗;NSE多克隆抗体∶抗体稀释液(1∶50)，以PBS代替一抗设空白对照，4℃孵育过夜，PBS漂洗3次，每次5min;生物素标记山羊抗兔二抗，37℃孵育30min，PBS漂洗3次，每次5min;辣根酶标记链霉素卵蛋白素工作液，37℃ 孵育30min，PBS漂洗3次，每次5min;避光条件下，DAB显色10min，自来水终止反应;苏木精染液复染细胞核，3min后自来水返蓝;95%乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片;晾干，镜下观察。
1.2.3 MTT测定 将96孔培养板中大鼠海马神经元培养至d7进行实验分组，即空白对照组(300μmol·L-1maltol)、铝负荷模型组[100μmol·L-1Al(malt)3]、干预组(Al3+ +10-5、3×10-6、10-6mol·L-1 DK睵GD2、CAY10471)。在加入处理因素后继续培养24h，每孔加入20μL的MTT溶液(5g·L-1)，37℃培养箱中孵育4h。弃去孔内上清液，加入150μLDMSO，摇床上避光震荡，以充分溶解结晶物，于570nm波长处测定吸光度值(OD值)。
1.2.4 乳酸脱氢酶(LDH)漏出率测定 将24孔培养板中大鼠海马神经元培养至d7进行实验药物处理(分组同“1.2.3”)，继续培养24h后，根据LDH测定试剂盒说明书具体步骤操作，于490nm波长处测定OD值。计算公式：细胞毒性或LDH漏出率/% =(处理样品OD值-样品对照孔OD值)/(细胞最大酶活性的OD值-样品对照孔OD值)×100。
1.2.5 海马神经元病理形态学观察 将24孔培养板中大鼠海马神经元爬片(10mm×10mm)培养至d7进行实验分组，即空白对照组(300μmol·L-1mal瞭ol)、铝负荷模型组[100μmol·L-1Al(malt)3]、干预组(Al3+ +10-5mol·L-1DK睵GD2、CAY10471)。在加入处理因素后继续培养24h，弃去细胞培养液，PBS漂洗3次，每次1min;4%多聚甲醛固定30min，PBS漂洗3次;HE染色，镜下观察。
1.2.6 Ca2+荧光强度测定 将共聚焦专用培养皿中大鼠海马神经元培养至d7进行药物处理(分组同“1.2.5”)，继续培养24h。弃去培养皿中培养液，采用Ca2+荧光探针Fluo3/AM标记活细胞内Ca2+，通过激光扫描共聚焦显微镜测定细胞内Ca2+荧光强度。1.2.7 统计学分析 所有实验结果均以珋x±s表示，采用SPSS17.0统计软件进行分析，组间比较采用单因素方差分析及Dunnett′st检验。
2 结果
2.1 原代培养大鼠海马神经元NSE免疫化学鉴定 培养至d7的神经元，在倒置光学显微镜下观察，其胞体饱满有光晕，轴突和树突明显，突起交错连接成网状。经NSE免疫细胞化学染色后，阳性细胞胞体及突起呈棕黄色;苏木精复染后，阳性细胞胞核呈蓝色。随机取6个视野，每个视野挑选100个细胞，计数NSE阳性细胞并计算其所占百分比。统计结果显示，超过95%为阳性细胞(Fig1)。
2.2 DP2干预对铝负荷原代培养大鼠海马神经元存活力的影响
2.2.1 DK睵GD2对铝负荷原代培养大鼠海马神经元存活力的影响 与空白对照组比较，铝负荷模型组MTT值明显降低(P<001);与铝负荷模型组比较，DK睵GD2干预组MTT值明显降低，且有剂量依赖性。
2.2.2 CAY10471对铝负荷原代培养大鼠海马神经元存活力的影响 与空白对照组比较，铝负荷模型组MTT值明显降低(P<001);与铝负荷模型组比较，CAY10471干预组MTT值明显升高，且有剂量依赖性。
2.3 DP2干预对铝负荷原代培养大鼠海马神经元LDH漏出率的影响
2.3.1 DK睵GD2对铝负荷原代培养大鼠海马神经元LDH漏出率的影响 与空白对照组比较，铝负荷模型组LDH漏出率明显升高(P<001);与铝负荷模型组比较，DK睵GD2 干预组LDH漏出率明显升高，10-5mol·L-1、3×10-6mol·L-1组差异有显著性(P<001。
2.3.2 CAY10471对铝负荷原代培养大鼠海马神经元LDH漏出率的影响 与空白对照组比较，铝负荷模型组LDH漏出率明显升高(P<001);与铝负荷模型组比较，CAY10471干预组LDH漏出率明显降低(P<001)。
2.4 DP2干预对铝负荷原代培养大鼠海马神经元病理形态学的影响 HE染色后，在正置光学显微镜下观察，空白对照组海马神经元结构清晰完整，胞体呈锥形或三角形，核仁明显，有双极或多极突起并相互交织成网;铝负荷模型组海马神经元细胞数目明显减少，突起萎缩，部分细胞核固缩;DK睵GD2干预组海马神经细胞几乎全部核固缩、裂解;CAY10471干预组海马神经元较模型组神经元结构完整，胞体、胞核明显，裂解细胞明显减少(Fig2、3)。
2.5 DP2干预对铝负荷原代培养大鼠海马神经元Ca2+荧光强度变化的影响 空白对照组海马神经元的Ca2+荧光强度极其微弱，铝负荷模型组Ca2+荧光强度明显增强(P<001);与铝负荷模型组比较，DK睵GD2干预组Ca2+荧光强度有增强趋势，但差异无显著性;CAY10471干预组Ca2+荧光强度明显降低(P<001)(Tab5、Fig4)。
3 讨论
铝作为一种公认的神经毒剂，过量蓄积可严重影响人的认知功能，进而诱发一系列神经系统疾病。与三氯化铝、葡萄糖酸铝等其他铝盐相比，麦芽酚铝[Al(malt)3]是一种中性含铝复合物，在生理pH条件能释放出大量Al3+，有利于进行铝负荷神经毒性的相关研究。本实验采用Neurobasal培养基(含2% B27)进行海马神经元的原代培养，通过神经元胞质内特异性标志物NSE的鉴定，其纯度超过95%。参考Chen等[11]并通过我们的前期实验摸索，本实验采用100μmol·L-1麦芽酚铝建立铝负荷大鼠原代海马神经元损伤模型。研究结果发现，与空白对照组比较，铝负荷原代培养大鼠海马神经元MTT值明显降低、LDH漏出率明显升高、Ca2+荧光强度明显增强，海马神经细胞数目明显减少、突起萎缩，部分细胞核固缩。Chen等[12]对麦芽酚铝致原代培养的大鼠皮层神经元损伤进行了研究，发现Al3+通过激活Rho睷ock信号通路诱导神经毒性。Johnson等[13]在原代培养的大鼠海马神经元中发现，麦芽酚铝可造成神经元呈时间和剂量依赖性凋亡，其作用机制可能与麦芽酚铝抑制脑源性神经生长因子(BDNF)，导致细胞内Ca2+升高有关。
我们实验结果还发现，与铝负荷模型组相比，DK睵GD2干预组MTT值明显降低、LDH漏出率明显升高、Ca2+荧光强度有增强趋势，海马神经细胞几乎全部核固缩、裂解;CAY10471干预组MTT值明显升高、LDH漏出率明显降低、Ca2+荧光强度明显减弱，海马神经元较模型组神经元结构完整，胞体、胞核明显，裂解细胞明显减少。有研究报道，DP2 偶联Gi蛋白，通过激活磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)，磷酸化丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(Ser50/Thr145)，激活糖原合成酶3(GSK3)，活化T细胞核因子的转换，释放炎性介质。也有研究报道，DP2被激活后偶联Gi蛋白，抑制cAMP水平，促进Ca2+ 内流，上调CD11b表达，诱导嗜碱性粒细胞迁移和脱颗粒，促进IL2、IL4、IL5、IL13的释放。Liang等[5]对天冬氨酸(NMDA)致原代海马神经元损伤进行了研究，发现DK睵GD2 加重神经元损伤。Schroder等[16]对炎性相关因子前列腺素H1(PGH1)进行了研究，发现CAY10471可抑制Th2细胞的迁移。结合本实验结果，DK睵GD2可能通过激动DP2，偶联Gi蛋白，增加细胞内Ca2+浓度，加重铝负荷原代培养大鼠海马神经元损伤;CAY10471可能通过抑制DP2活性，减少Ca2+流入，对铝负荷原代培养大鼠海马神经元损伤起一定保护作用。
综上所述，DP2 激活表达可增加神经元对铝盐损伤的易感性，其机制可能涉及DP2下游Ca2+信号通路的调控，但由于作用复杂，在神经系统中的机制尚不完全清楚。因此，在本研究的基础上，可对DP2在神经系统中介导的下游Ca2+信号通路的具体调控机制进行深入研究。
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